液相色谱仪与质谱仪的联用

  色谱-质谱联机技术结合了色谱对复杂基体化合物的高分离能力与质谱独特的选择性、灵敏度、分子量及结构信息于一体，具有广泛的应用领域。现色谱-质谱主要有气相色谱-质谱和液相色谱-质谱（HPLC-MS）。气相色谱-质谱的联用技术已趋于成熟，它适于易挥发、半挥发性有机小分子化合物的分析。然而据估计已知化合物中约70%的化合物均为亲水性强、挥发性强的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物广泛存在于当前应用和发展最广泛、最有潜力的领域，包括生物、医药、环境等方面，因而液相色谱! 质谱的联机显得更为迫切。液相色谱-质谱的联用在20世纪,) 年代以后进入实用阶段。与气相色谱-质谱已取得的成功相比，液相色谱-质谱的联用还有些技术难题有待解决，主要是色谱系统各种难挥发溶剂的排除问题。
  液相色谱-质谱联用仪主要由色谱仪、接口、质谱仪、电子系统、记录系统和计算机系统六大部分组成。混合样品注入色谱仪后，经色谱柱得到分离。从色谱仪流出的被分离组分依次通过接口进入质谱仪。在质谱仪中首先于离子源处被离子化，然后离子在加速电压作用下进入质量分析器进行质量分离。分离后的离子按质量的大小，先后由收集器收集，并记录质谱图。根据质谱峰的位置和强度可对样品的成分和其结构进行分析。所采用的色谱仪和质谱仪在基本结构和工作原理上与普通色谱仪和质谱仪无大差别，只是在某些方面有些特殊要求。
  但是，在液相色谱仪和质谱仪联用时，还有以下困难需要解决： ①色谱仪与质谱仪的压力匹配问题。质谱仪要求在高真空［1.33*（10^（-2）-10^(-5)Pa 即10^(-5)mmHg-10^(-7)mmHg］情况下工作，而液相色谱仪柱后压力约为常压（760mmHg）。色谱流出物直接引入质谱的离子源时，可能破坏质谱仪的真空度而不能正常工作。
  色谱仪与质谱仪的流量匹配问题。一般质谱仪最多只允许1mL/min-2mL/min气体进入离子源，而流量为1mL/min的液体流动相气化后，气体的流量150mL/min-1200mL/min 489。
  气化问题。被色谱分离后的样品必须以气态的、未发生裂解和分子重排的形式进入质谱仪离子源。这就要求色谱流出物在进入质谱仪以前气化。HPLC的流出物为液体，必须采用不使组分发生化学变化的方法使之气化。
  要解决以上矛盾，实现液相色谱仪与质谱仪的联机，一般要在两种仪器之间加入一种称为接口的连接装置。接口是色谱-质谱的关键部件，它起着除去大量色谱流动相分子、浓集和气化样品的作用。接口性能很大程度上决定着色谱! 质谱联用仪性能的优劣。
  （一）LC-MS联机技术
  1. 传送带式接口
  传送带式接口是将HPLC流出物滴加到运动着的传送带上，溶剂被加热蒸发掉，样品由传送带送入离子源电离。传送带式接口的优点是对样品的收集率和富集率都高。但其缺点却较多：如色谱展宽，只适于对热稳定的样品，有记忆效应以及在反相HPLC中有一定的限制等。
  2. 液体直接进样系统
  当HPLC采用微径柱时，可以让柱后流出物直接全部导入质谱仪离子源；当HPLC采用普通内径柱时，通过分流让一部分流出物直接进入质谱仪，但样品利用率低。该法适于不挥发和热不稳定化合物，可以用于反相HPLC。
  3. 热喷雾接口
  利用一根似探针的加热输送管和特殊设计的离子源，先将流动相加热蒸发，再把喷出液滴中的挥发组分快速蒸发，在此过程中将电荷转移至分析物分子中，然后使生成的离子导入质谱系统。用离子源内的灯丝、放电电极，即所谓断裂电极可以提高离子化效率，除了提供通常的质子化分子离子（或负离子形式中的分子阴离子）给予的分子量信息外，有时还提供结构信息。热喷雾接口技术被用于分析热不稳定、极性和大的分子，特别是用在药物、农业和环境化学领域及许多基础学科。
  热喷雾对待分析物的类型有一定的限制。一般要求分子有一定的极性，而且流动相要有一定量的水。该技术通常在进入MS 的流量为1mL/min 左右时工作最佳，采用柱后加入也适用于微孔径色谱柱。热喷雾主要提供分子量信息，而且溶剂加合物或缓冲液成分的出现也使热喷雾不是一个鉴定未知物的最佳方法。由于热喷雾谱图与工作条件关系极大，目前还没有商品化的热喷雾MS 谱库。
  4. 粒子束接口技术
  粒子束LC-MS将LC-MS 分析的应用范围扩展得比热喷雾更宽，它还可用于带电子轰击和化学电离方式的质谱。粒子束接口将电离过程与溶剂分离过程分开，因此使接口更适合于使用不同的流动相，不同的分析物质，得到不同谱图信息。
  雾化器用每分钟几升的氦气同轴加到LC流出液，将LC流动相喷成微滴，气体和液滴混合物通过一个两极动量分离器除去氦气，再将液滴中的溶剂蒸发，然后经过一段短毛细管进入加热的质谱离子源。微粒在此被热源蒸发，再用常规电子轰击或各种反应气体的化学电离进行电离，既可用正离子方式也可用负离子方式。
  传送带式接口和液体直接进样系统开发较早，目前已少用。热喷雾和粒子束两种接口设计，缺乏专一性和足够的灵敏度。在确定化合物时，热喷雾常不能提供足够多的碎片。受挥发性、极性、分子量限制，粒子束不能使非挥发性化合物电离，不能测定低于10^(-9)G水平的样品。由于热喷雾和粒子束质谱的灵敏度不能与液相色谱的紫外检测器、二极管阵列检测器相匹配，已不能满足色谱工作者需求，技术仍需进一步完善。由于早期接口的复杂性、不稳定性和灵敏度不高的缘故，1993年出现的大气压电离技术有取代热喷雾、粒子束、快速轰击质谱等的趋势。以下就对这种大气压电喷雾源和大气压化学源作简要介绍。
  在进行质谱分析时，首先要把样品分子或原子电离成离子，产生离子的装置叫离子源。目前比较普遍的是电子轰击源（EI）和化学离子源（CI）。EI 是在高真空下，用强电子流直接轰击气态样品，使之发生电离。EI源重现性好，所得信息量多，但分子离子峰丰度小。CI是利用低压的样品气和高压的反应气受电子流轰击，反应气首先被打掉电子形成离子，这些离子再接受样品分子的电子，发生离子分子反应来完成样品的离子化的。化学电离属于软电离方式，解析图谱较容易，缺点是重现性差。其它离子化方式还有场电离、场解吸电离、快速原子轰击电离、二次离子质谱等。
  而一种称为大气压离子化（API）的接口离子化方式目前已发展成为商品技术，如惠普公司的LC-MSD。大气压离子化技术是一类软离子化方式，适用范围非常广泛，常用于代谢研究和大量药物成分的分析。API技术可分为两种类型：电子喷雾（API-ES）和化学电离（APCI）。在342 , 1" 中，离子的形成是被测分子在带电液滴的不断收缩过程中喷射出来的，即离子化是在液态下完成的。具体地说，就是经液相色谱分离的样品溶液流入离子源，在N2流下气化后进入强电场区域，强电场形成的库仑力使小液滴样品离子化，借助于逆流加热N2，分子离子颗
  粒表面液体进一步蒸发，使分子离子相互排斥形成微小分子离子颗粒。这些离子可能是单电荷或多电荷，这取决于所得的带有正、负电荷的分子中酸性或碱性基团的体积和数量。多电荷离子峰的形成使质量范围为3000 的四极杆滤过器质谱仪也能检测到生物大分子的准确分子量。API-ES 比较适应下列样品的分析：带多电荷的蛋白质、多肽、寡聚核苷酸（分子量可高达150000），带单电荷的苯并二氮杂艹卓类和磺化共轭物类以及大多数聚合物。大气压化学源与电喷雾相似，所不同的是通过电晕放电针使溶剂首先离子化，离子化的溶剂与待测分析物发生离子交换化学反应，使分析物离子化，即对低分子量和中等分子量有机化合物（<1600）而言，APCI是很好的普遍使用的LC-MS。实际分析时，可在两种方式中选择切换。
  大气压电离技术的出现使LC-MS成为一种灵敏度高（pg 级）、选择性强、样品用量少、分析速度快的仪器联用分析方法。电喷雾源多电荷的形成使其成为蛋白质生物分子研究领域不可缺少的手段，该法的高灵敏度使生物学家能够在分子水平上研究蛋白质转移修饰，如糖基化、磷酸化、二硫键、脱酰胺基作用、蛋氨酸或色氨酸的氧化作用等，真正揭示结构与生物功能的关系。化学源对于极性较小的化合物（如烃类、醚类、醛类）也能获得理想的结果，在有机化合物分析中扮演重要角色，特别是在药物分析，从原材料筛选、生产过程中质量控制、到成品纯度鉴定及药物毒理、临床等领域都展现了一定的使用潜力。

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